Transformação Genética De Eucalyptus Saligna Com O Gene P5Csf129A Via Agrobacterium Tumefaciens – Roberson Dibax

Transformação Genética De Eucalyptus Saligna Com O Gene P5Csf129A Via Agrobacterium Tumefaciens – Roberson Dibax
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Resumo:

No Brasil, especialmente na região Sul, os estresses causados por baixas temperaturas são os que mais influenciam de forma negativa a produtividade de Eucalyptus spp. Diante desta limitação, os programas de reflorestamento perderam o interesse pelo cultivo do Eucalyptus saligna e substituíram esta espécie por outras que apresentam maior resistência ao frio. O objetivo desta pesquisa foi a obtenção de plantas de Eucalyptus saligna geneticamente transformadas com o gene P5CSF129A, que codifica um mutante da enzima chave P5CS (1-pirrolina-5-carboxilato sintetase) da síntese do aminoácido L-prolina, cuja propriedade de aumentar a tolerância ao frio já foi confirmada em algumas espécies de plantas. Este trabalho foi dividido em duas etapas, sendo a primeira orientada no estudo da organogênese e micropropagação para a espécie e a segunda etapa referente à otimização da transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens com o gene P5CSF129A e sua expressão nas plantas de Eucalyptus saligna. Na primeira etapa, genótipos da espécie foram estabelecidos a partir de folhas cotiledonares cultivadas em meio de cultura MS contendo 2,70 μM de ANA e 4,44 μM de BAP. Após a seleção de um genótipo para o cultivo in vitro, foram realizados estudos para determinar a concentração de BAP que forneça a taxa de multiplicação mais elevada em meio MS com as concentrações de nitratos de potássio e amônio reduzidos à metade (MSM). Foram comparadas as concentrações a seguir: 0; 1,11; 2,22; e 4,44 μM. Os melhores resultados foram obtidos com a utilização de 1,11 a 3,33 μM de BAP. Estudos de regeneração de gemas a partir de explantes foliares foram realizados em meio de cultura MSM contendo 0,1 μM de ANA combinado com 1,0; 1,5 e 2,0 μM de TDZ, seguido de 0,67 μM de ANA e 1,11 μM de BAP. O melhor resultado foi obtido após o cultivo dos explantes em meio contendo 0,1 μM de ANA e 1,0 μM de TDZ por 30 dias, seguido de 0,67 μM de ANA e 1,11 μM de BAP, proporcionando uma taxa de regeneração de 30%. Para o alongamento, as brotações foram cultivadas durante 28 dias em meio de cultura MSM contendo 2,5% de carvão ativado e em seguida transferidas para o meio de enraizamento MS/2 (com a concentração dos sais reduzida de metade) por mais 28 dias. As micro-estacas enraizadas foram aclimatizadas em casa-de-vegetação utilizando o substrato Plantmax®, proporcionando uma taxa de sobrevivência de 80% após 28 dias Com relação à transformação genética, os melhores resultados na expressão transiente do gene GUS foram obtidos com a utilização de segmentos foliares (meia folha), co-cultivados durante 5 dias após a inoculação em solução bacteriana de DO600nm=0,5, e este tratamento foi utilizado para a transferência do gene de interesse. A co-cultura foi realizada no escuro em meio MSM contendo 0,1 μM de ANA e 1,0 μM de TDZ. Após, os explantes foram transferidos para o mesmo meio contendo 500 mg.L-1 de cefotaxima (Cx) e 50 mg.L-1 de canamicina (Km) por dois períodos de 28 dias e em seguida a concentração de Cx foi reduzida para 250 mg.L-1. Os calos que se formaram nos explantes foliares foram transferidos para o meio MSM contendo 0,67 μM de ANA e 1,11 μM de BAP por mais 28 dias sob condições de luz até a formação de gemas. Estas foram transferidas para o meio MS contendo 1,45 μM de GA3 durante 14 dias e, finalmente, para o meio de multiplicação contendo 1,11 μM de BAP. A transformação genética foi confirmada num evento por PCR seguido de Southern blot. O nível de prolina foi medido no evento e apresentou um aumento de quatro vezes em comparação com o controle, confirmando o incremento na biossíntese de prolina. Concluiu-se neste trabalho que o genótipo de Eucalyptus saligna utilizado apresentou um comportamento responsivo na indução da organogênese nos tecidos estudados e possibilitou a transformação genética da espécie com o gene P5CSF129A.

Detalhes:

  • Categoria: Teses e dissertações
  • Instituição: UFPR/AGRONOMIA (PRODUÇÃO VEGETAL)
  • Área de Conhecimento: AGRONOMIA
  • Nível: Doutorado
  • Ano da Tese: 2008
  • Tamanho: 5.02 MB
  • Fonte: Portal Domínio Público

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