Investigação Da Conformação De Bothropstoxina I (Pla2-Lys49) Do Veneno De Bothrops Jararacussu Em Solução E Em Associação Com Membranas Artificiais – Tatiana Lopes Ferreira

Teses e dissertações PDF
Acessar

Resumo:

A hidrólise de fosfolipídios de membrana pela fosfolipase A2 da classe-II (PLA2) é dependente do co- factor Ca2+ que é parcialmente coordenado pelo resíduo de Asp49 na região do sítio ativo. Nos homólogos de Lys49-PLA2; o Asp49 é substituído por Lys e as Lys49- PLA2s não mostram ligação de Ca2+ ou hidrólise de fosfolipídios detectável. As Lys49-PLA2s mostram uma liberação rápida Ca2+-independente de marcadores encapsulados em lipossomos e demonstra potentes atividade bactericida e miotóxica. Bothropstoxina-I (BthTx-I) é uma Lys49-PLA2 homodimérica presente no veneno da serpente Bothrops jararacussu. Estudos precedentes de cristalografia de raio X e de espectroscopia de fluorescência mostraram que o homodímero age como uma dobradiça molecular; permitindo a transição entre as conformações “aberta” e “fechada” de BthTx-I; sugerindo previamente que transições conformacionais similares do dímero na presença de membrana pode causar a atividade de danificação de membrana Ca2+-independente. Com o objetivo de compreender as mudanças estruturais de Lys49-PLA2s; o modelo de interação do BthTx-I com membranas foi estudado utilizando mutagênese de varredura do triptofano (MVT) em conjunto com espectroscopia de fluorescência intrínsica do triptofano (Trp). O único resíduo Trp77 da interface do dímero foi substituído previamente por histidina (W77H) sem efeitos significativos na estabilidade do homodímero ou na função biológica. No estudo atual; uma segunda etapa de mutagê nese sítio-dirigida utilizando W77H como molde produziu 9 mutantes separados cada um com um resíduo único de Trp localizado na interface do dímero (nas posições 7 e 10); na superfície dorsal (nas posições 46 e 104); na superfície ventral (nas posições 31 e 67) e na região da alça C-terminal (nas posições 117; 119 e 125). Após a expressão em E. coli; enovelamento da proteína recombinante; e purificação por cromatografia de troca catiônica; os mutantes foram caracterizados usando uma série de análises bioquímicas e biofísicas. A correlação entre a liberação do marcador encapsulado com estudos de interação da proteína com membranas de lipossomos demonstrou que uma eficiente permeabilização da membrana pode ocorrer por uma associação transiente entre a proteína e a membrana. Todos os mutantes mostraram uma atividade similar indicando que as interações hidrofóbicas possuem um papel secundário no estudo de afinidade da proteína pela membrana. Por outro lado; o aumento da proporção de carga negativa na membrana aumentou a ligação da proteína sugerindo que interações eletrostáticas possuem um papel importante nos estudos de interação. As cinéticas de modificação química dos resíduos de triptofano por bromosuccinamida foram correlacionadas com as mudanças de emissão intrínseca do RESUMO triptofano; confirmando que os resíduos situados no Sítio de Reconhecimento Interfacial (SRI) da proteína interagem com a região hidrofóbica da bicamada da membrana. Resultados adicionais indicam que os resíduos da região C-terminal da proteína interagem com a superfície da bicamada; em contraste com atual consenso sobre a função desta região no mecanismo de danificação da membrana. Os resíduos de triptofano na região da interface dimérica podem participar da homotransferência de energia ressonante (HTER); e este efeito pode ser estudado através de alterações na anisotropia de fluorescência intrínseca do triptofano. Os mutantes K7W e L10W demonstram uma anisotropia de fluorescência reduzida; consistente com o efeito de homotransferência de energia. Uma vez que HTER é somente eficiente sob distâncias curtas; estes dados suportam fortemente a sugestão que o homodímero de BthTx-I adota uma conformação fechada em solução. Estes dados experimentais mostram uma correlação qualitativa com resultados de simulações de dinâmica molecular; que oferecem a possibilidade de compreender as mudanças estruturais subjacentes da atividade de danificação da membrana de Ca2+-independent e de BthTx-I.

Detalhes:

  • Categoria: Teses e dissertações
  • Instituição: USP/RP/BIOQUÍMICA
  • Área de Conhecimento: BIOQUÍMICA
  • Nível: Doutorado
  • Ano da Tese: 2008
  • Tamanho: 2.56 MB
  • Fonte: Portal Domínio Público

Faça download do ebook em PDF:

Recomendamos para você

Abaixo você vai encontrar uma lista de livros que na nossa opinião podem ser interessantes para você.

São itens relacionados a esta oferta que você provavelmente vai gostar. Dá uma olhada! 👌

Termos relacionados

  • livro Investigação Da Conformação De Bothropstoxina I pdf
  • livro Investigação Da Conformação De Bothropstoxina I baixar
  • livro Investigação Da Conformação De Bothropstoxina I epub
  • livro Investigação Da Conformação De Bothropstoxina I comprar
  • livro Investigação Da Conformação De Bothropstoxina I online
  • livro Investigação Da Conformação De Bothropstoxina I mobi
  • livro Investigação Da Conformação De Bothropstoxina I download