Interações Moleculares No Mecanismo De Ação De Clorocatecol 1,2-Dioxigenase E Da Tirosina Quinase Fgfr2 – Fernando Alves De Melo

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Resumo:

Neste trabalho foi utilizado um esquema multi-técnicas para estudar as interações moleculares no mecanismo de ação de clorocatecol 1;2-dioxigenase e da tirosina quinase FGFR2. Na primeira parte desta tese; descrevemos uma série de experimentos envolvendo a interação da enzima clorocatecol 1;2- dioxigenase (1;2-CCD) com seus ligantes naturais e também com miméticos de membranas biológicas (micelas de surfactantes; monacamadas lipídicas e lipossomos). Utilizamos a técnica de calorimetria de titulação isotérmica (ITC) para mostrar que tanto o substrato; quanto o produto da reação inibem a cinética enzimática mediada por 1;2-CCD. Resultados obtidos com as técnicas de calorimetria de varredura diferencial (DSC) e ressonância paramagnética eletrônica (RPE) confirmaram que a inibição se dá devido à ligação direta do produto da reação no sítio catalítico da enzima. Sendo assim; nossos dados indicam que o produto da reação exerce um papel relevante na catálise mediada por 1;2-CCD; devendo ser levado em consideração para estudos futuros que versem sobre a regulação da atividade desta enzima. Em outra vertente; investigamos a capacidade de 1;2-CCD de se ligar a modelos de membranas. Para isso; utilizamos as técnicas de RPE; DSC e de monocamadas de Langmuir no monitoramento das alterações nos miméticos de membranas (micelas dos surfactantes SDS e CTABr; monocamdas de DPPC e lipossomos de DPPC e DMPC) quando da adição de 1;2-CCD. Este conjunto de dados aponta claramente para a existência da referida interação; o que pode representar; junto com a inibição por produto; outro mecanismo de regulação do metabolismo desta enzima dentro da célula. Na segunda parte de nosso estudo; utilizamos a técnica de ITC para acessar as cinéticas de autofosforilação de FGFR2 quinase e de fosforilação; catalisada por FGFR2 quinase; da isoforma p52 da proteína Shc. A fosforilação reversível da cadeia lateral de aminoácidos é um princípio de regulação da atividade de enzimas e sinalização de proteínas largamente utilizado pelas células. Para tornarem-se ativas; proteínas tirosina quinase (PTK) autofosforilam-se hidrolisando moléculas de ATP em ADP em uma reação sequencial e precisamente ordenada. Uma vez ativas; interagem com proteínas adaptadoras; como Shc; que são fosforiladas pelo intermédio de PTK. Assim que é fosforilada; Shc torna-se apta a interagir com outras proteínas importantes no processo de sinalização celular para formar os complexos de sinalização primários (ESC). Nossos resultados mostram que o processo de autofosforilação da FGFR2 é governado por uma cinética cooperativa e com a ordem de fosforilação dos resíduos de tirosina provavelmente idêntica àquela previamente determinada para FGFR1. Já para a fosforilação de Shc; a cinética tende a mudar com a temperatura; sendo que a 10 oC ocorre segundo um mecanismo de Michaelis- Menten; enquanto que a 15oC podemos identificar uma indefinição de comportamento deste sistema; uma vez que os dados podem ser ajustado pelos modelos de Michaelis-Menten e Hill. Já para 20 oC; vemos uma mudança no perfil catalítico; mostrando um certo grau de cooperatividade. Estes resultados; além de estabelecerem características da cinética de fosforilação de FGFR2 e Shc ainda não reportadas; também validam o método calorimétrico utilizado para determinar os parâmetros cinéticos associados àquele processo.

Detalhes:

  • Categoria: Teses e dissertações
  • Instituição: USP/SC/FÍSICA
  • Área de Conhecimento: FÍSICA
  • Nível: Doutorado
  • Ano da Tese: 2010
  • Tamanho: 7.54 MB
  • Fonte: Portal Domínio Público

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