Construção E Caracterização De Vírus Febre Amarela 17D Recombinantes Expressando O Domínio Iii Da Proteína E Do Vírus Dengue 2 Na Região Intergênica E/Ns1 Do Vírus Fa17D – Ana Luiza Chaves Valadão

Construção E Caracterização De Vírus Febre Amarela 17D Recombinantes Expressando O Domínio Iii Da Proteína E Do Vírus Dengue 2 Na Região Intergênica E/Ns1 Do Vírus Fa17D – Ana Luiza Chaves Valadão
Acessar

Resumo:

A dengue é uma arbovirose transmitida ao homem por meio da picada de insetos vetores que albergam o vírus dengue (gênero Flavivírus; família Flaviviridae). Este vírus apresenta-se como 4 sorotipos (den-1 a den-4); antigenicamente distintos; embora todos possuam mesma epidemiologia e causem os mesmos sintomas. A infecção por dengue é caracterizada por amplo espectro de manifestações clínicas e sua re-emergência é responsável por grande impacto na saúde pública mundial. Apesar de diversas tentativas para o desenvolvimento de uma vacina contra dengue; nenhuma ainda está disponível. Neste trabalho utilizamos o vírus vacinal da Febre Amarela 17D (FA 17D) para expressão do domínio III (DIII) da proteína de envelope (E) de den- 2; na região intergênica E/NS1; baseado nas boas propriedades da vacina contra FA. A escolha do DIII den-2 justifica-se por ele estar associado a processos de infecção celular e por ser o principal indutor de resposta imune mediada por anticorpos neutralizantes dirigida à partícula viral. O estudo de alinhamento do DIII de diferentes genótipos e a sua modelagem molecular permitiram uma melhor caracterização desta região em relação à sua variabilidade; mutantes de escape de neutralização e sítios de ligação a receptores celulares. A abordagem de expressão do DIII da proteína E de den-2 no genoma do vírus FA 17D baseou-se na montagem do cassete de expressão contendo motivos duplicados de aminoácidos conservados; flanqueadores da região intergênica E e NS1 (Bonaldo et al.; 2007); permitindo desta forma; o correto processamento da poliproteína viral em associação ao retículo endoplasmático (RE) celular. Foram gerados dois diferentes vírus FA recombinantes que albergavam a inserção heteróloga correspondente ao DIII den-2; indicando que esta inserção não acarretou em um grande comprometimento da estrutura e função virais. Estes vírus FA recombinantes diferiam entre si quanto à porção C-terminal do cassete de expressão; onde um deles apresentava uma mutação no sítio de clivagem da enzima peptidase sinal do hospedeiro; entre as proteínas E e NS1. A expressão do DIII den-2 por ambos os recombinantes foi confirmada por imunofluorescência confocal. Seus perfis proliferativos foram avaliados por meio de cinética de replicação em monocamadas de células Vero; onde os vírus recombinantes exibiram menores taxas de replicação quando comparados aos controles. A estabilidade genética destes recombinantes foi analisada por passagens seriadas em culturas de células Vero; cujos sobrenadantes foram submetidos a RT-PCR para avaliação da presença da inserção heteróloga. Ambos os vírus mostraram-se estáveis até a 5ª passagem seriada e apresentaram perda total do cassete de expressão a partir da décima passagem. No entanto; o vírus que apresentou a mutação em sua porção C-terminal foi ainda mais instável; pois mostrou deleção de cerca de 300 aminoácidos no cassete de expressão. A perda da inserção heteróloga em ambas as construções virais sugere que a clonagem e expressão de DIII den-2/HA truncada den-4 exerce um efeito deletério na viabilidade viral. No entanto; este fato não limita a utilização destes vírus como modelo de estudos para vacinação e indução de anticorpos neutralizantes dirigidos ao vírus den-2 ou outro Flavivírus.

Detalhes:

  • Categoria: Teses e dissertações
  • Instituição: FIOCRUZ/BIOLOGIA PARASITÁRIA
  • Área de Conhecimento: PARASITOLOGIA
  • Nível: Mestrado
  • Ano da Tese: 2008
  • Tamanho: 5.17 MB
  • Fonte: Portal Domínio Público

Faça download do ebook em PDF: